一、引言

在過(guò)去的20年里，公眾對(duì)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品的興趣迅速增長(zhǎng)。許多人將營(yíng)養(yǎng)飲料作為代餐和膳食補(bǔ)充劑。多種因素影響著這些飲料的購(gòu)買(mǎi)和消費(fèi)。其中一個(gè)關(guān)注點(diǎn)包括這些飲料以蛋白質(zhì)、氨基酸和/或脂肪含量的形式為個(gè)人飲食增加的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。此外，制造商分析并控制這些主要成分至關(guān)重要，以便優(yōu)化生產(chǎn)、控制成本并生產(chǎn)高質(zhì)量的產(chǎn)品。

傳統(tǒng)方法通常依賴(lài)于繁瑣且耗時(shí)的天平濕化學(xué)技術(shù)。¹ 作為替代方案，CEM提供了一系列儀器，以更高效、可靠和環(huán)保的方式滿(mǎn)足這些需求。例如，粗脂肪分析的參考方法包括索氏提取法（Soxhlet）、巴布科克法（Babcock）和莫尼耶法（Mojonnier extraction）。這些技術(shù)依賴(lài)于添加溶劑溶解并分離樣品基質(zhì)中的所需脂肪，并且通常伴隨著酸/堿水解。ORACLE™ 提供了一種吸引人的替代方法，無(wú)需校準(zhǔn)或方法開(kāi)發(fā)即可測(cè)量任何樣品類(lèi)型的脂肪。ORACLE可以與SMART 6™ 配對(duì)使用，直接在幾分鐘內(nèi)準(zhǔn)確測(cè)定固體和脂肪含量。

總蛋白質(zhì)測(cè)定也依賴(lài)于苛刻的凱氏定氮硫酸消化，隨后通過(guò)滴定或燃燒方法來(lái)確定總氮含量。Sprint^® 使用染料結(jié)合技術(shù)，其中CEM的iTag^® 染料分子選擇性地結(jié)合到蛋白質(zhì)中的基本氨基酸側(cè)鏈上。這不僅提供了針對(duì)性的方法，還允許測(cè)試在不到五分鐘內(nèi)完成，且使用的試劑不需要化學(xué)廢物處理。

除了總蛋白測(cè)量外，構(gòu)成這些蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的數(shù)量和身份也很重要。為了分析這些部分，必須切割蛋白質(zhì)酰胺鍵以釋放單個(gè)氨基酸。樣品通常在110°C下在酸性或堿性條件下處理18至24小時(shí)，然后通過(guò)LC-UV或LC-MS技術(shù)分析所得水解產(chǎn)物。傳統(tǒng)加熱機(jī)制的特點(diǎn)，如反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)和不希望發(fā)生的副反應(yīng)，困擾著傳統(tǒng)的烘箱方法。CEM的Discover^® Prep微波反應(yīng)器為優(yōu)化氨基酸水解（AAH）反應(yīng)提供了一條快速高效的途徑。^2,3

在此，我們使用CEM儀器分析了各種營(yíng)養(yǎng)飲料的總脂肪、固體和蛋白質(zhì)含量，并為L(zhǎng)C-UV氨基酸分析進(jìn)行了準(zhǔn)備?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果與其各自的傳統(tǒng)濕化學(xué)技術(shù)相比表現(xiàn)良好，但以更快速、精確和安全的方式實(shí)現(xiàn)。

二、材料與方法

實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)

化學(xué)品購(gòu)自商業(yè)供應(yīng)商并直接使用，無(wú)需進(jìn)一步純化。所有溶液在使用前均新鮮配制。各種營(yíng)養(yǎng)飲料從當(dāng)?shù)仉s貨店購(gòu)買(mǎi)，并在分析前儲(chǔ)存在干燥陰涼的地方。所有樣品一經(jīng)開(kāi)封即進(jìn)行分析，并儲(chǔ)存在4°C的環(huán)境中。

分析

SMART 6、ORACLE和Sprint獲得的分析結(jié)果與傳統(tǒng)濕化學(xué)法（分別來(lái)自相應(yīng)的AOAC參考方法：固體990.20、脂肪989.05和蛋白質(zhì)981.10）進(jìn)行比較。

Discover Prep的有效性與傳統(tǒng)烘箱進(jìn)行了比較。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，將200毫克的營(yíng)養(yǎng)飲料用移液管轉(zhuǎn)移到干凈且干燥的10毫升玻璃小瓶中，隨后加入2毫升含有1%苯酚（w/v）的6 N HCl。然后將小瓶用氮?dú)獯祾撸杆倜芊?，然后放?10°C的烘箱中24小時(shí)。色氨酸的分析遵循堿性水解協(xié)議，其中使用4 N NaOH代替HCl。Discover Prep微波輔助AAH反應(yīng)的準(zhǔn)備如下：將200毫克樣品添加到配有卵形攪拌棒的35毫升Pyrex小瓶中。分別向每個(gè)小瓶中加入5毫升含有1%苯酚（w/v）的6 N HCl或4 N NaOH用于酸性或堿性水解。用氮?dú)饬鞔祾咝∑课宸昼?，迅速用Teflon®襯硅膠帽密封，并放置在自動(dòng)進(jìn)樣器架上以自動(dòng)化方式放入Discover Prep腔體中。Discover Prep AAH方法參數(shù)見(jiàn)表1。完成烘箱和微波反應(yīng)后，冷卻的樣品被中和并過(guò)濾，為柱前衍生做準(zhǔn)備。所有氨基酸水解產(chǎn)物使用Waters AccQ-Tag™ Ultra衍生試劑盒進(jìn)行衍生，并通過(guò)注射到連接有PDA檢測(cè)器（260 nm）的Waters Acquity H-Class UPLC上的Waters AccQ-Tag Ultra C18柱（1.7 µm, 2.1 x 100 mm）進(jìn)行分析。⁴

表1. Discover Prep氨基酸水解參數(shù)

三、結(jié)果與討論

表2和表3分別展示了從SMART 6和ORACLE獲得的固體總量和脂肪結(jié)果。在各種營(yíng)養(yǎng)飲料中，這些結(jié)果與傳統(tǒng)的烘箱干燥法測(cè)定固體和莫尼耶醚提取法測(cè)定脂肪的結(jié)果非常一致。在所有情況下，CEM儀器的結(jié)果與傳統(tǒng)方法在±0.10%的范圍內(nèi)匹配，無(wú)論樣品成分如何。此外，就精確度而言，結(jié)果也相當(dāng)可比，所有百分比相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（%RSD）均保持在1%以下。

Sprint在分析成人和兒童營(yíng)養(yǎng)飲料風(fēng)味時(shí)也表現(xiàn)出色，如表4所示。在這種情況下，Sprint結(jié)果顯示的%RSD低于傳統(tǒng)的凱氏定氮法。進(jìn)一步地，面對(duì)使用各種蛋白質(zhì)來(lái)源配制的樣品，包括豌豆蛋白、牛奶蛋白分離物和乳清蛋白時(shí)，Sprint也證明了其成功性。

表2. 使用SMART 6與烘箱干燥法測(cè)定各種營(yíng)養(yǎng)飲料中固體百分比的結(jié)果比較

表3. 使用ORACLE與傳統(tǒng)莫尼耶脂肪提取法測(cè)定各種營(yíng)養(yǎng)飲料中脂肪百分比的結(jié)果比較

表4. 使用Sprint與傳統(tǒng)凱氏定氮法測(cè)定各種營(yíng)養(yǎng)飲料中蛋白質(zhì)百分比的結(jié)果比較

對(duì)于氨基酸水解，選擇了一款巧克力和香草味的成人營(yíng)養(yǎng)飲料進(jìn)行分析。樣品進(jìn)行了酸性和堿性水解，以準(zhǔn)備進(jìn)行18種氨基酸的LC-UV分析。使用Discover Prep微波反應(yīng)器獲得的結(jié)果在準(zhǔn)確性和精確度方面與傳統(tǒng)烘箱水解法相當(dāng)，回收率在80%至120%之間（見(jiàn)圖1和圖2）。

圖1. 巧克力營(yíng)養(yǎng)飲料中18種氨基酸的水解回收率

圖2. 香草營(yíng)養(yǎng)飲料中18種氨基酸的水解回收率

四、結(jié)論

消費(fèi)者對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的關(guān)注顯著影響了全球產(chǎn)品的生產(chǎn)、監(jiān)管和分銷(xiāo)。這一點(diǎn)與嚴(yán)格的監(jiān)管要求相結(jié)合，凸顯了對(duì)高效、可靠且穩(wěn)健的成分分析方法的不斷增長(zhǎng)的需求。傳統(tǒng)的分析方法通常耗時(shí)較長(zhǎng)，常常需要數(shù)小時(shí)，并且需要使用有害化學(xué)品。SMART 6、ORACLE和Sprint成功地以比傳統(tǒng)濕化學(xué)法更高效的方式分析了營(yíng)養(yǎng)飲料中的總固體、脂肪和蛋白質(zhì)含量。Discover Prep被用來(lái)成功地準(zhǔn)備各種營(yíng)養(yǎng)飲料進(jìn)行18種氨基酸的LC-UV分析。在準(zhǔn)確性和精確度方面，Discover Prep與傳統(tǒng)烘箱水解法相當(dāng)。CEM儀器系列的額外關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)包括易于使用的軟件和更安全的實(shí)驗(yàn)室操作流程，同時(shí)保持了準(zhǔn)確性和精確度。

五、引用

1.Otles, S., Ozyurt, V.H. Classical Wet Chemistry Methods. In Handbook of Food Chemistry.; Springer, 2014; pp 1-14.

2.Chen, P.-K.; Rosana, M. R.; Dudley, G. B.; Stiegman, A. E.Parameters Affecting the Microwave-Specific Acceleration of a Chemical Reaction. J. Org. Chem. 2014, 79 (16), 7425-7436.

3.Dudley, G. B.; Richert, R.; Stiegman, A. E. On the existence of and mechanism for microwave-specific reaction rate enhancement. Chem. Sci. 2015, 6, 2144-2152.

4.Hong, P.; Johnson, D.; Trinite, D. A.; Warren, B.; Zhang, N.Hydrolysis and Analysis of Amino Acids from Purified Peptides/Proteins, Foods, and Feeds; Waters Corporation, 2019.

Teflon^® is a registered trademark of the DuPont Corporation,now Chemours.

AccQ-Tag™ is a trademark of Waters Corporation.